조선 말기(병오년) 홍성지역에서 있었던 의병운동에서 일본군과 싸우다 희생된 분들의 유해를 모신 곳이다. 1905년 일본의 강압으로 을사박탈조약이 체결되고, 홍주지역에서는 1906년(병오년)에 전 이조참판 민종식이 채광묵, 박인기, 이만식, 농민, 유생 구 관리를 중심으로 홍주성에 쳐들어갔다. 당시 홍성군수 이교석과 이주승도 처음에는 의병군에 호응할 기미였다가 일본군 다수가 입성한다는 소식에 성문을 닫고, 입성을 막아 부득이 물러났다. 3월 22일에 재차 홍주성에 쳐들어갔으며, 5월 19일에 드디어 홍주성을 함락시켰다. 후 일본군이 5월 25일부터 홍주성의 의병군을 공격하여 30일부터 본격전이 시작되었으며, 그때에 일본군 대포에 의해 조양문이 부서졌다. 중과 부적으로 의병 수백 명이 전사하여 시체가 대교리 일대의 냇가와 남산 일대에 흩어져 있었다. 1949년 4월 5일 홍성군수 박주철과 홍성경찰서장 박헌교가 직원들을 인솔하고 현재 의사총이 있는 부근에서 식수하던 중 많은 유골을 발견하게 됐다. 옛 노인에게 설명을 듣고 병오 항일의병 시 전사한 의병군의 유골이 임시매장된 것으로 판명되었고, 유골을 모아 이곳에 합장하여 분묘를 조성하여 현재의 모습이 있게 하였다. 1992년 구백의총(九百義塚)이란 이름을 홍주의사총으로 바꿨으며, 매년 5월 30일에 순국의사에 대한 추모제를 지내고 있다. 충청남도 기념물 제4호로 지정받았다가 2001년 8월 17일 국가지정문화재로 지정받았다.